临床输液反应以热原反应危害最大，发生率最高。内毒素（即革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖分子，lipopolysaccharide，LPS）注射即使是pg级别的痕量LPS也会导致病人严重的热原反应，引起人体发热、休克甚至死亡。因此，灵敏可靠的内毒素分析技术是非常必须的。
目前细菌内毒素检查主要依赖于鲎试剂，可分为凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
内毒素的低回收率现象（Low Endotoxin Recovery,LER）是当前经常讨论的话题。内毒素低回收率是指对已经添加细菌内毒素标准品的生物制药产品采用药典规定方法进行细菌内毒素检查时加标内毒素检出失败的现象，而这种现象通常表现为回收率过低，内毒素被掩蔽。如果“内毒素掩蔽”发生，意味着该内毒素的活性形式（超分子结构）发生了变化，从而检测到的值要比实际低。因加入细菌内毒素标准品的药品内毒素回收失败，生产过程中被内毒素污染的含热原产品会因内毒素不能被检出而被放行，导致含热原的产品因用于商业用途而被患者使用的风险仍旧存在。
2013年，FDA开始要求生物制品上市申请（Biologicslicensing applications，BLA）的申请人须提交在药品中加入内毒素标准品后，使用USP规定的细菌内毒素检查方法可以检出药品中预加入的细菌内毒素。在BLAs中关于内毒素加标试验及内毒素保持时间的研究遇到了很大难点，这推动FDA需要获取更多信息或额外的研究来说明。但是不同公司和不同研究的spike/hold study存在明显的差异。
加标样品的细菌内毒素的检出受样品的制备方法影响（包括预处理及涡旋时间等），同时细菌内毒素标准品的类型、细菌内毒素标准品的加入量、保持时间、被加标样品的温度、内毒素回收率的计算方式、检查的执行等均可引起测试结果的明显差异，这增加了对结果进行比较和分析难度。等电点（Isoelectric points，pI)大于8或具有正电结构的特定蛋白质会束缚加入样品中的内毒素标准品从而引起LER。
内毒素掩蔽是时间依赖性的，这意味着如果掩蔽发生，内毒素的回收率随时间降低。要降低低回收率现象，可以选择具有足够高浓度的样品，然后进行稀释从而排除或减少干扰。
此外，除了回收率低这一现象，内毒素检测中也存在假阳性这一问题。这主要是因为除了内毒素，内毒素检测所用的鲎试剂还与某些β-葡聚糖反应，产生假阳性结果。科学研究表明，含有高浓度蛋白质和聚山梨酯等非离子型表面活性剂的生物制剂结合使用后，往往会改变内毒素分析物的聚集态，以至于内毒素的检测存在问题。
鲎试剂是从鲎的血液中提取出的冻干试剂，可以与细菌内毒素发生凝集反应。2021年2月5日，《国家重点保护野生动物名录》将我国分布的鲎科动物（中国鲎、圆尾蝎鲎）升级为国家二级保护动物。这无疑对依赖鲎试剂的内毒素检测造成了影响。
2020版中国药典《9251细菌内毒素检查法应用指导原则》提出，可使用重组C因子法进行内毒素检测。
重组C因子（rFC）内毒素检测是一种不依赖于动物源性成分、灵敏度高、特异性高、可稳定且持续提供的替代鲎试剂的内毒素测定方法。
C因子是传统鲎试剂中对细菌内毒素敏感的蛋白，能够选择性地识别内毒素。重组C因子利用基因重组技术表达的内毒素特异性酶，被活化后可直接与荧光底物作用，产生与内毒素浓度成正比的荧光信号，从而实现定量。相对于传统鲎试剂，重组C因子法可以为我们带来以下优点：
1、保护鲎资源
rFC方法无动物源，保护了鲎资源，也符合现在3R保护理论，即对使用实验动物的实验应替代、减少、优化。
2、避免β-葡聚糖的干扰
传统鲎试剂检测方法由于存在旁路反应（鲎试剂中的G因子在β-葡聚糖存在下也可以引起反应），会造成假阳性。而重组C因子方法从原理上就避免了这种干扰。
3、标准化
鲎血是个复杂的成分，不同个体、不同时间、地点采集的鲎血都会有所不同，这就造成了鲎试剂存在一定的批次间波动。而重组C因子方法由于其可控的生产工艺，可以保证其批间稳定性。使企业实现标准化检测。
4、持续稳定供给
对于内毒素检测的需求在急剧增加，但是鲎资源却在急剧紧缩。这种供需关系也为鲎试剂的使用带来的很大风险。重组C因子法基于其可无限重复的生产工艺，可以保证持续稳定的供给。
2018年，FDA批准了基于rFC试剂进行内毒素检测的药物。这为rFC检测方法的广泛采用打开了大门。作为一种合成试剂，rFC可以替代来源于鲎血液的美洲鲎试剂（LAL）和东方鲎试剂（TAL）用于内毒素检测。rFC试剂的主要优点是提高了一致性和可持续性。变异是所有动物源性产品的共同特征，合成的一致性可以使生产和检测过程更容易控制，并且由于可以无限制地的生产rFC，从而更具可持续性。
参考文献
[1]Johannes Reich, Felix Alexander Weyer, HiroshiTamura, Isao Nagaoka and Hubert Motschmann. Low Endotoxin Recovery—Maskingof Naturally Occurring Endotoxin. Int J Mol Sci. 2019 Feb; 20(4): 838. doi:10.3390/ijms20040838.
[2]李京华,邵英光,岳丽娜&王俊德.(2006).动态比浊法定量测定内毒素的标准曲线斜率与回收率的关系.药物分析杂志,26(7),4.